Способ трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови



РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
http://www.fips.ru/but2/RFP_LOGO.gif
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ 

(19)

RU

(11)

2 734 121 

(13)

C1



(52) СПК

  • A01N 1/02 (2020.02) 

  • C12N 5/00 (2020.02) 

 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ 

Статус:
Пошлина:

действует (последнее изменение статуса: 26.03.2021)
учтена за 3 год с 20.04.2021 по 19.04.2022

 

(21)(22) Заявка: 2019112035, 19.04.2019 

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:
19.04.2019 

Дата регистрации:
13.10.2020 

Приоритет(ы):

(22) Дата подачи заявки: 19.04.2019 

(45) Опубликовано: 13.10.2020 Бюл. № 29 

(56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: СТЕПАНОВ А.А. и др. "Алгоритм получения гематопоэтических стволовых клеток из периферической крови для аутологичной трансплантации", Биомедицинский журнал Medline.ru. Трансфузиология. 2013; 14:255-265. RU2514349 C1, 27.04.2014. FREISE K.J. et al. "The effect of anticoagulant, storage temperature and dilution on cord blood hematology parameters 

over time", Int J Lab Hematol. 2009; 31(5): 496-504; DOI: 10.1111/j.1751-553X.2008.01066.x. ГРИШИНА В.В. "Разработка оптимальных методов криоконсервирования кроветворных клеток пуповинной крови человека для трансплантации", Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2006; 1(3):52-59.

Адрес для переписки:
191024, Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, 16, ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России 

(72) Автор(ы):
Кузяева Анастасия Александровна (RU),
Чечеткин Александр Викторович (RU),
Волошин Сергей Владимирович (RU),
Шуваев Василий Анатольевич (RU),
Рысев Георгий Александрович (RU),
Шмидт Александр Владимирович (RU),
Сельцер Александра Валерьевна (RU),
Балашова Валентина Андреевна (RU),
Чубукина Жанна Викторовна (RU),
Гарифуллин Андрей Дамирович (RU),
Кувшинов Алексей Юрьевич (RU),
Линников Сергей Юрьевич (RU),
Михалева Мария Андреевна (RU),
Ходот Анастасия Валерьевна (RU) 

(73) Патентообладатель(и):
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства" (ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России) (RU) 

(54) Способ трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови 

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови. Способ включает заготовку и хранение аутологичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови в виде лейкослоя, взвешенного в многокомпонентном растворе антикоагулянта, без доступа воздуха при температуре (+3)-(+5)°С в течение 3-6 суток с последующей реинфузией. Изобретение позволяет исключить замораживание клеток при хранении. 3 табл., 2 пр.

 

Заявляемое изобретение относится к медицине, а именно, к методам лечения злокачественных новообразований кроветворной, лимфоидной и родственных им тканей и, в частности, к проведению высокодозной химиотерапии (ВДХТ) с последующей аутологичной трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток (ауто-ТГСК) периферической крови (ПК).

Программное лечение большинства лимфопролиферативных новообразований, в том числе множественной миеломы (ММ), непременно включает высокодозную химиотерапию с последующей ауто-ТГСК [Ljungman P.J. et al. Bone Marrow Transplantation, 2010, 45, 219-234].

Данный вид лечения включает проведение отдельных стандартных этапов: заготовка (сбор/коллекция/эксфузия) гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) ПК и/или костного мозга (КМ), криоконсервирование и хранение ГСК, их размораживание и реинфузия (возврат) пациенту после завершения подготовительного режима ВДХТ. От качества проведения каждого из этих этапов зависит скорость восстановления кроветворения, что в свою очередь определяет успех трансплантации, снижает риски развития осложнений и увеличивает общую выживаемость пациентов [Davies S.M. et al. Blood, 2000, 96:4096-102].

Ауто-ТГСК периферической крови могут быть заготовлены только до начала подготовительного химиотерапевтического режима (кондиционирования), не позднее, чем за 1 сутки до начала подготовительного периода; после начала кондиционирования заготовка ауто-ТГСК невозможна в связи с миелосупрессивным действием химиопрепаратов. Трансфузия ауто-ТГСК проводится в срок не менее 24 часов после последнего введения химиотерапевтического агента.

Известен стандартный способ поддержания жизнеспособности ауто-ТГСК путем управляемого криоконсервирования взвеси ГСК с использованием внутриклеточного криопротектора диметилсульфоксида (ДМСО); криоконсервированные ГСК до проведения трансплантации (реинфузии) хранят в парах жидкого азота при сверхнизких температурах (ниже -180°С) в условиях биологического хранилища (криобанка) [Bakken A.M. Cryopreserving human peripheral blood progenitor cells. Curr Stem Cell Res Ther. 2006; 1:47-54; см. также RU 2623081, A01N 1/02, 2017; RU 2623083, A01N 1/02, 2017; RU 2623864, A01N 1/02, 2017].

Однако при криоконсервировании и последующем размораживании значительная часть собранных ГСК (20-30%) разрушается и утрачивает жизнеспособность из-за необратимой активации раннего апоптоза [F. de Boer, A.M. Drager, H.M. Pinedo et al., "Extensive early apoptosis in frozen-thawed CD34-positive stem cells decreases threshold doses for haematological recovery after autologous peripheral blood progenitor cell transplantation", Bone Marrow Transplantation, vol. 29, no. 3, pp. 249-255, 2002]. Кроме того, реинфузии ГСК, подвергнувшихся криоконсервированию, вызывают у больных ряд тяжелых побочных и токсических эффектов ДМСО: тошноту, рвоту, боли в животе, а также сердечнососудистые, неврологические, респираторные, почечные, печеночные и гемолитические осложнения.

Результат, на достижение которого направлено заявляемое изобретение, заключается в том, чтобы исключить токсические эффекты, связанные с введением ДМСО при реинфузии.

Указанный результат достигается тем, что в способе трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови, включающем заготовку, хранение и реинфузию аутологичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови, заготовленные стволовые клетки в виде лейкослоя, взвешенные в многокомпонентном растворе антикоагулянта, переводят в контейнер, исключающий проникновение кислорода из воздуха, и хранят в указанном контейнере без доступа воздуха в антикоагулянтном растворе при температуре (+3) - (+5)°С в течение 3-6 суток.

В качестве контейнера, исключающего проникновение (подсос) кислорода воздуха в содержимое, может быть использован, например, стандартный контейнер для криоконсервирования крови и ее компонентов или любой другой контейнер с двухслойными стенками.

В качестве раствора антикоагулянта может быть использован многокомпонентный раствор на основе цитрата натрия (типа ACD Solution, formula A® (ACD-А) или другие стандартные растворы, применяемые при заготовке крови и ее компонентов.

Лейкослой, используемый для ауто-ТГСК, получают путем стандартного афереза на сепараторе клеток крови (типа Terumo ВСТ Spectra Optia Apheresis System® или Haemonetic MCS+®). В соответствии с указанной технологией, отделенный лейкослой обогащен гемопоэтическими стволовыми клетками CD34+ и содержит некоторое количество тромбоцитов и эритроцитов.

Продукт аппаратного афереза ГСК ПК от момента заготовки и до его реинфузии при ауто-ТГСК может храниться при температуре +3 - +5°С в медицинском оборудовании для хранения крови, компонентов лекарственных средств и вакцин типа

Sanyo MPR или Pozis ХФ-400-2, в том же мешке для криоконсервирования клеток крови (типа CrioMax750®), в котором он был заготовлен.

Нами было обнаружено, что хранение нативной взвеси ГСК с антикоагулянтом раствором ACD-A без доступа воздуха в мешке, исключающем подсос воздуха, в медицинском холодильнике при колебаниях температуры от +3°С до +5°С в течении 5 (пяти) суток значимо не влияет ни на содержание CD34+ клеток в продукте, ни на количество 7AAD- клеток и колониеобразующую способность (КОС) ГСК, а главное - на сроки восстановления кроветворения у больных ММ после ауто-ТГСК. При этом удавалось избежать типичных для инфузий криоконсервированных с ДМСО ГСК осложнений.

Далее изобретение пояснено примерами конкретного воплощения.

Пример 1

Для оценки эффективности способа была выбрана группа из десяти пациентов, 5 женщин и 5 мужчин, страдающих множественной миеломой (ММ). Все пациенты получали стандартные программы иммунохимиотерапии и на момент проведения ауто-ТГСК находились в состоянии ремиссии заболевания.

Аферез ГСК производился с помощью систем аппаратного цитафереза. Полученный лейкослой, обогащенный CD34+ стволовыми клетками, засасывали в пакет для криоконсервирования, из которого предварительно удаляли воздух. Хранение осуществлялось в тех же пакетах для криоконсервирования при колебаниях температуры от +3°С до +5°С в течении 5 суток в медицинском холодильнике. Медиана срока хранения составила 4 (2-6) суток.

Количество CD34+ клеток определялось методом проточной цитофотометрии. Жизнеспособность клеток аферезного продукта оценивалась по показателю 7-AAD-. 7-AAD (7-аминоактиномицин-Д) - флуоресцентный маркер, проникающий через поврежденные клеточные мембраны и связывающийся с двуспиральной ДНК. Через интактные мембраны этот маркер не проникает, таким образом, живые клетки не окрашиваются 7-аминоактиномицином-Д при флуоресцентной микроскопии или проточной цитометрии. Показатель 7-AAD- ГСК на момент трансплантации составил в среднем 89,5±7,25%. Перед реинфузией ГСК КОС (гранулоцитарные и гранулоцитарномакрофагальные колонии) клеток аферезного продукта составляла 65,5±61,24×105/л колоний.

Предпочтительным режимом кондиционирования для проведения ауто-ТГСК была выбрана стандартная высокодозная химиотерапия мелфаланом (MEL200) с дозировкой лекарственного препарата 200 мг/м2, вводимой внутривенно в равных дозах в 1-й и 2-й дни [Kerry Atkinston. The ВМТ data book: a manual for bone marrow and blood stem cell transplantation, pp. 76-77, 1997]. Основанием для выбора данного режима явилась его короткая продолжительность (3 дня). Аутологичная трансплантация ГСК производилась через 24 часа в условиях боксированных палат блока интенсивной терапии. Среднее содержание CD34+ клеток в аферезном продукте на момент реинфузии ГСК составило 2,49±0,6×105/кг веса пациента.

Все пациенты перенесли реинфузию аутологичных ГСК без значимых реакций и осложнений. Медиана сроков восстановления уровня нейтрофилов выше 1,0×109/л - 10 (10-12) суток, уровня тромбоцитов более 25×109/л - 11 (10-17) суток. Среди осложнений посттрансплантационного периода были отмечены: фебрильная нейтропения у 6 (60%), энтеропатия у 3 (30%), мукозит с присоединением кандидоза верхних отделов желудочно-кишечного тракта у 2 (20%) пациентов. Медиана продолжительности нахождения в стационаре после ауто-ТГСК составила 16 (13-19) суток.

Пример 2 (контрольный)

Для сравнения была взята контрольная группа из 16 больных ММ (10 мужчин и 6 женщин), которым были проведены аналогичные процедуры сбора и реинфузии ГСК ПК. Аферезный продукт криоконсервировали в присутствии ДМСО и хранили при сверхнизких температурах в условиях криобанка. Все больные после индукционной иммунохимиотерапии находились в состоянии ремиссии заболевания. Количество CD34+ клеток в продукте перед реинфузией в среднем составило 2,5±0,5×105/кг веса пациента. Показатель 7-AAD- размороженных ГСК составил в среднем 91,1±6,32%. Колониеобразующая способность ГСК в среднем составила 109,5±45,7×105/л колоний.

У 14 пациентов (87,5%) при проведении реинфузии ГСК были отмечены реакции на ДМСО в виде: тошноты и рвоты у 5 пациентов (31%), тахикардии более 90 ударов в минуту у 7 (44%), эпизоды стенокардии у 2 пациентов (12,5%), повышение общего билирубина и индикаторных печеночных ферментов (АлАТ, АсАТ) выше верхней границы нормы у 2 пациентов (12,5%). Подобные осложнения отсутствовали в 1 группе пациентов. Среди осложнений посттрансплантационного периода были отмечены: фебрильная нейтропения - у 12 (75%), энтеропатия - у 8 (50%), мукозит и кандидоз слизистой полости рта - у 2 (12,5%) пациентов.

https://fips.ru/ofpstorage/IZPM/2020.10.13/RUNWC1/000/000/002/734/121/%D0%98%D0%97-02734121-00001/00000001-m.jpg

https://fips.ru/ofpstorage/IZPM/2020.10.13/RUNWC1/000/000/002/734/121/%D0%98%D0%97-02734121-00001/00000002-m.jpg

Статистически значимые различия в количестве CD34+ клеток при реинфузии, значении показателя 7AAD-, КОС, сроках восстановления кроветворения и продолжительности нахождения в стационаре после ауто-ТГСК не выявлены (табл. 1 и 2).

https://fips.ru/ofpstorage/IZPM/2020.10.13/RUNWC1/000/000/002/734/121/%D0%98%D0%97-02734121-00001/00000003-m.jpg

Из данных, представленных в таблице 3, видно, что статистически значимых различий в количестве осложнений посттрансплантационного периода между пациентами 1 и 2 примеров также не выявлено, однако, прослеживается тенденция к более высокой частоте осложнений при использовании криоконсервированных ГСК.

Таким образом, предложенный способ трансплантации гемопоэтических стволовых клеток не уступает традиционному способу с криоконсервированием по таким параметрам как количество CD34+ клеток и 7AAD- клеток, колониеобразующая способность, количество необходимых трансфузий тромбоцитного концентрата, сроки приживления гранулоцитарного и мегакариоцитарного ростков кроветворения, продолжительность нахождения в стационаре после ТГСК, количество осложнений в посттрансплантационном периоде. В то же время предложенный способ исключает этапы криоконсервирования, хранения в условиях криобанка и разморозки ГСК, а главное - снижает частоту осложнений и исключает токсические эффекты, связанные с введением ДМСО при реинфузии.

Заявляемый способ увеличивает доступность ауто-ТГСК за счет вовлечения в процесс оказания медицинской помощи методом трансплантации ГСК медицинских учреждений, имеющих инфраструктуру для лечения больных злокачественными новообразованиями кроветворной, лимфоидной и родственных им тканей, но не имеющих структурных подразделений для обеспечения процесса криоконсервирования биологических сред. Он также позволяет экономить ресурсы благодаря исключению этапов «замораживания, хранения и размораживания» ГСК из технологии проведения ауто-ТГСК.

Формула изобретения

Способ трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови, включающий заготовку, хранение и реинфузию аутологичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови, отличающийся тем, что заготовленные стволовые клетки хранят в виде лейкослоя, взвешенного в многокомпонентном растворе антикоагулянта, без доступа воздуха при температуре (+3)-(+5)°С в течение 3-6 суток.